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儀器分析課件 熒光一.ppt

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第十四章 熒光分析法第一節 概述 某些物質受到光照射時,吸收某種波長的光之后,會發射出比原來吸收波長更長的光,當激發光停止照射,這種光線也隨之消失,此種光稱為熒光(fluorescence)。 含有少量Cr3+的釔鋁石榴石綠色晶體用蘭色激光照射石榴石綠色晶體時, Cr3+吸收蘭光并輻射出能量較低的紅色熒光.晶體的熒光現象熒光分析法x?射線熒光分析法 紫外?可見熒光分析法 紅外熒光分析法 根據激發光的波長范圍 分子熒光分析法 原子熒光分析法 化學發光 光致發光 根據激發所用能源 根據待測物質的存在形式 優點:A.靈敏度高, 檢出限10-10~10-12g/ml(紫外:10-7g/ml) B.選擇性好。 C.試樣量少和方法簡便 D.提供比較多的物理參數缺點:應用范圍較窄 干擾因素多二、基本原理 在每個電子能級上,都存在振動、轉動能級; 基態(S0)→激發態(S1、S2、激發態振動能級):吸收特定頻率的輻射;量子化;躍遷一次到位;第一、第二、…電子激發單重態 S1 、S2… ;第一、第二、…電子激發三重態 T1、T2 … ;電子激發態的多重度: M=2S+1S為電子自旋量子數的代數和(0或1);自旋量子數:1/2;-1/2; 單重態: 2S+1=1 三重態:2S+1=3 電子處于激發態是不穩定狀態,返回基態時,通過輻射躍遷(發光)和無輻射躍遷等方式失去能量;傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內轉移外轉移系間跨越振動弛預無輻射躍遷振動弛豫:從同一電子能級的各較高振動能級逐步返回到最低振動能級。內部能量轉換:兩個電子能級之間的能量轉換。外部能量轉換:激發態分子與溶劑分子或其它榮指分子相互作用及能量轉移。體系間跨越:指不同多線態間的無輻射躍遷。 激發態停留時間短、返回速度快的途徑發生的幾率大,發光強度相對大;熒光:10-7~10 -9 s,第一激發單重態的最低振動能級→基態;磷光:10-4~10s;第一激發三重態的最低振動能級→基態;第二激發 態單線態基 態第一激發 態單線態第一激發 態三線態S1VnT1S0S2λ′λ1(f)磷光(d)熒光(a)吸收V1V4V3V2(b)振動馳豫(b)λ2V0(e)體系間跨越V0V0V0V2V2V2V4V4V4V3V3V3V1V1V1圖13-1 熒光與磷光產生示意圖(c)內部能量轉換熒光發射:電子由第一激發單重態的最低振動能級→基態( 多為 S1→ S0躍遷),發射波長為 ? 2的熒光; 10-7~10 -9 s 。 由圖可見,發射熒光的能量比分子吸收的能量小,波長長; 磷光發射:電子由第一激發三重態的最低振動能級→基態( T1 → S0躍遷);發射波長為 ? ’2的磷光 電子由S0進入T1的可能過程:( S0 → T1禁阻躍遷) S0 →激發→振動弛豫→內轉移→系間跨越→振動弛豫→ T1 發光速度很慢: 10-4~100 s 。 光照停止后,可持續一段時間。 ? ’2 > ? 2 > ? 1 ;三、激發光譜與發射光譜 熒光物質分子都具有兩個特征光譜,即激發光譜和發射光譜(熒光光譜)。激發光譜:固定測量波長(選最大發射波長),化合物發射的熒光(磷光)強度與照射光波長的關系曲線。 激發光譜曲線的最高處,處于激發態的分子最多,熒光強度最大;發射光譜:固定激發光波長(選最大激發波長), 化合物發射的熒光(或磷光強度)與發射光波長關系曲線(圖中曲線II或III)。激發光譜與發射光譜的關系 a.Stokes位移 激發光譜與發射光譜之間的波長差值。發射光譜的波長比激發光譜的長,振動弛豫消耗了能量。 b.發射光譜的形狀與激發波長無關 電子躍遷到不同激發態能級,吸收不同波長的能量(如能級圖? 2 ,? 1),產生不同吸收帶,但均回到第一激發單重態的最低振動能級再躍遷回到基態,產生波長一定的熒光(如? ’2 )。 但是熒光強度與激發波長有關。 吸收越強,發射熒光強度越大,故常選最大激發波長光作激發光 c. 鏡像規則 通常熒光發射光譜與它的吸收光譜(與激發光譜形狀一樣)成鏡像對稱關系。 第三節 熒光與分子結構的關系一、分子結構與熒光的關系(一)熒光物質的必要條件 分子產生熒光,必須具備兩個條件:(1)物質分子必須有強的可見-紫外吸收 分子結構應具有共軛結構(或含不飽和雜原子基團),產生 躍遷或 躍遷*pp*pn(2)分子吸收輻射能后,必須具有一定的熒光量子產率。 即熒光效率( )應足夠大。通常:0< <1 fj吸收激發光的量子數發出熒光的量子數=fjfj(二)分子結構與熒光的關系1.躍遷類型:K帶強吸收 激發: 發射:2.長共軛結構物質,易產生 共軛程度越大,產生熒光強度越強,熒光效率越大,波長長移。強pp?*例: 苯 萘 蒽 9-乙烯蒽 λex 205 286 356 λem 278 321 404 432 φf 0.11 0.29 0.36 0.76 共軛鍵越長,熒光強度越大,熒光波長長移。CH=CH23.分子剛性和共平面性結構(剛性共平面結構) 大多數具有剛性共平面結構的有機物具有強烈的熒光例: 聯苯 芴CH2例 酚酞熒光極弱 熒光素熒光強烈COC=OHOOHCOC=OOHOOH 例1:哪個熒光強度強? 8-羥基喹啉 8-羥基喹啉鎂NONOHMg1/2弱熒光物質 強熒光物質1-二甲胺基-7-磺酸鹽1-二甲胺基-8-磺酸鹽SO3NaNCH3CH3SO3NaCH3NCH3(位阻效應)φf=0.75φf=0.03C=CHHC=CHH反式二苯乙烯順式二苯乙烯有強熒光無強熒光4.取代基(1)對共軛體系作用大的給電子基團,增加共軛效應,使熒光效率增強,熒光波長長移。例:-OH,-OR,-NH2,-CN,-NR2等飽和雜原子基團。(2)對共軛體系作用大的吸電子基團,減弱 π 電子共軛性,使熒光減弱甚至熄滅。例:-COOH,-NO2,-C=O, -NO,-SH,-NHCOCH3, -F,-Cl,-Br,-I等。OHNO2熒光波長 270~310 285~365nm熒光強度 10 18 0例:(3)對共軛體系作用效小的基團,對熒光的影響不明顯。例: -R,-SO3H,-NH3。三、影響熒光強度的外。省略部分。不同波長 激發下的熒光與散射光譜320nm360nm448nm激發光320nm硫酸奎寧350nm400nm350nm320nm360nm448nm激發光350nm硫酸奎寧激發光320nm0.01mol/LH2SO4激發光350nm0.01mol/LH2SO4思考題如何區別熒光、磷光、瑞利光和拉曼光? 6.熒光熄滅劑 熒光熄滅: 指熒光物質分子與溶劑分子或溶質分子相互作用引起熒光強度降低的現象 熒光熄滅劑: 引起熒光熄滅的物質稱為熒光熄滅劑例:-X,Cu2+、Zn2+等。 O2、-NO、-COOH等1、碰撞,損失能量2、相互作用生成不發光的配合物3、引入溴或碘,發生體系間的跨越4、O2的氧化,或氧分子的順磁性促進體系間的跨越,單線態轉至三線態。5.熄滅劑分子和熒光物質分子間的相互作用有選擇性。7.表面活性劑的影響 表面活性劑形成的膠束溶液,有增溶、增穩和增敏作用,可大大提高熒光分析法的靈敏度和穩定性。第四節 熒光分光光度計光源激發單色器樣品池檢測器發射單色器I0狹縫表面吸光物質狹縫狹縫放大器指示器記錄器儀器結構流程 測量熒光的儀器主要由四個部分組成:激發光源、樣品池、雙單色器系統、檢測器。 特殊點:有兩個單色器,光源與檢測器通常成直角,樣品池四面透光。光源:強度大,高壓氙燈、汞燈、氙-汞弧燈、閃光燈和激光器,應用最廣泛的是高壓氙燈。檢測器:光電倍增管。二、儀器類型:1)濾光片熒光計(930) 2)濾光片——單色器熒光計 3)熒光分光光度計 光源第一濾光片光欄樣品池第二濾光片光欄檢測器放大及記錄光電熒光計示意圖(930型)儀 器 光 路 圖三、熒光計的校正1、波長校正 用汞燈的標準譜線來校正2.靈敏度校正靈敏度:用檢出限表示檢出限:用某一標準熒光物質的稀溶液在一定激發波長的照射下,能發射出最低信噪比時的熒光強度的最低濃度靈敏度影響因素:(1)光源強度(2)單色器(包括透鏡、反射鏡等)的性能(3)放大系統的特征(4)光電信增管的靈敏度(5)測定波長 狹縫寬度 溶劑的Raman散射 激發光、雜質熒光 由于熒光光度計靈敏度的影響因素很多,因此,每次測定時先用一種穩定的熒光物質,配成濃度一定的標準溶液進行校正,(調50%或100%)(1)標準溶液本身(熒光穩定)(2)硫酸奎寧標準溶液(1μg/ml,0.05mol/LH2SO4溶液)3、激發光譜和熒光光譜的校正 目前多采用雙光束光路.第五節 定性與定量一、定性分析 一般用純品作為對照測定激發光譜和熒光光譜或光譜數據(λex 和λem)進行定性。二、定量分析1.熒光強度與濃度的關系低濃度時:F=KC 由于熒光物質是在吸收光能而被激發之后才發射熒光的,因此,溶液的熒光強度與該溶液中熒光物質吸收光能的程度以及熒光效率有關。溶液中熒光物質被入射光激發后,可以在溶液的各個方向觀察熒光強度。推導:在與入射光垂直的方向上測量熒光強度,為了消除入射光和散射光的影響。I0IF1、熒光強度正比于吸收的光強度與熒光量子數:吸收的光強度2、依據Lambert-Beer定律:式中()()+..-+-+-+=-3303.223.21)3.2(13213.2EClEClECleECl﹗﹗﹗時當05.0£ECl 當入射光強度I0一定,則 注:只有濃度極稀的條件下,上式才成立熒光分析法: 定量依據:F=KC 靈敏度取決于:儀器靈敏度1、燈源強度大:氙燈,高壓汞燈。2、高靈敏度的檢測器: 改進光電倍增管和放大系統,放大熒光強度紫外-可見分光光度法: 定量依據:A=ECl =kC A=-lgT=-lgI/I0 檢測的是 I/I0 ,即使放大光強信號, I/I0比值仍然不變,對提高檢測靈敏度不起作用,故:紫外-可見分光度法靈敏度低于 熒光分析法靈敏度(二)、定量分析方法1、標準曲線法(1)配置空白溶液,標準溶液、樣品溶液 C0 C1 C2 C3 C4 C5……Cx(2)儀器凋零(3)用濃度最大的標準溶液(C5), 尋找背景最低,熒光最強的激發光波長和熒光波長(4)分別測量各溶液的熒光強度 F0 F1 F2 F3 F4 F5 Fx(5)計算熒光強度校正值 (6)作Fi-F0~Cs標準曲線,求回歸方程(8)求樣品含量2、比較法要求:標準曲線過原點 Cs與Cx相近(1)配 Cs Cx Co (2) 測 Fs Fx Fo (3) 計算: Fs-Fo=KCs Fx-Fo=KCx 3、多組分混合物熒光分析 依據:F=KC 熒光強度具有加和性 方法:解線性方程組1、關于熒光效率,下面錯誤的敘述是( )A、具有長共軛的 躍遷的物質具有較大的熒光效率B、分子的剛性和共平面性越大,熒光效率越大C、順式異構體的熒光效率大于反式異構體的熒光效率D、共軛體系上的取代基不同,對熒光效率的影響也不同課堂練習2、關于熒光,錯誤的敘述是:()A、受激分子從第一激發態單線態的各個振動能級返回至基態時所發射出的光為熒光B、熒光波長短于激發光波長C、磷光波長長于熒光波長D、溶液中存在順磁性物質可使熒光減弱5、下列關于熒光光譜的敘述何者是錯誤的:( )A、熒光光譜的形狀與激發光的波長無關B、熒光光譜和激發光譜一般是對稱鏡像關系C、熒光光譜是分子的吸收光譜D、熒光的激發光譜和紫外吸收光譜形狀相似9、關于振動弛豫,下而不正確的敘述是:( )A.振動弛豫只能在同一電子能級內進行B.振動弛豫屬于非輻射躍遷C.通過振動弛豫可使處于不同電子激發態的分子均返回到第一電子激發態的最低振動能級D.振動弛豫是產生Stokes shift位移的原因之一10.用波長320nm的入射光激發硫酸奎寧的稀硫酸溶液時,將產生320nm的( )A.瑞利光 B.磷光C.熒光 D.拉曼光
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