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雞蛋溶菌酶提取.doc

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?雞蛋溶菌酶提取溶菌酶(又稱胞壁質酶或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶)是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。主要通過破壞 細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵,使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,導致細胞壁破裂內容物逸出而使細菌溶解。溶 菌酶還可與帶負電荷的病毒蛋白直接結合,與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽,使病毒失活。性質:白色或微白色凍干粉,溶 于水,不溶于乙醚和丙酮,pI為11.0-11.35,最適pH值6.5。穩定性:酸性介質中可穩定存在,堿性介質中易失活;96℃, pH值為3條件下,15min后活力保持87%。抑制劑有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性劑(十二烷基硫酸鈉、醇類和碳鏈不少于12的脂肪酸)。1%水溶 液在281.5nm處的吸光系數為26.4。通過水解細菌細胞壁的肽聚糖來溶菌作用:溶菌酶的用途極為廣泛,在醫藥上,可與 血液中的病毒結合,阻止流感、腺病毒等的繁殖;能分解粘多糖,有利于膿汁、痰液的排出;能清除壞死組織、增進抗生素的藥效以及促進腸道有益細菌如乳酸菌的 繁殖等作用;另外,它與抗生素聯合應用還可治療支氣管炎、肺炎、白喉、小兒急性腎炎等多種疾病。在食品上,卵清溶菌酶是無毒的蛋白質,能選擇性地使目標微 生物細胞壁溶解,而對其他物質無反應,人們利用它來代替有害健康的化學防腐劑(如苯甲酸及其鈉鹽),以達到保存食物的目的,是一種天然防腐劑;溶菌酶添加 于牛乳,可使牛乳人乳化,提高了牛乳的營養價值。提取工藝:(一) 雞蛋清中提取溶菌酶方法一——食鹽鹽析一.材料:原料:雞蛋、NaOH、NaCl、丙酮、(市售溶菌酶粉劑)儀器與設備:攪拌器(200-300r/min),離心機(4000r/min),抽濾機二.工藝流程:原料 → 清洗 → 去蛋殼 → 分離蛋清 → 攪拌 → 過濾 → 加鹽 → 調節pH值 → 結晶 → 干燥 → 成品 → 包裝三.實驗步驟:1選擇新鮮雞蛋,蛋清的pH值不能低于8.0,否則不能用。2清洗:用水洗掉蛋殼表面的不潔之物。3將雞蛋的兩端各敲一個小洞,使蛋清流出。4用攪拌機攪拌,將蛋清攪拌稠度均勻即可,以不引起泡沫為宜,防止由于起泡引起蛋白質的泡沫變性,而影響溶菌酶活性及產率。5過濾:用雙層紗布將稠度均勻的蛋清過濾,濾除蛋清溶液中的臍帶塊及蛋殼等。6加鹽:按50:1的比例(NaCl:蛋清液),向蛋清液中加入NaCl細粉,邊攪拌邊加入促使NaCl細粉及時溶解,以避免NaCl沉于容器底部,而因局部濃度過高而產生大量的白色沉淀7 結晶:用1mod/l的NaOH溶液調節PH為9.5-10.0,邊攪拌邊加,避免過堿引起蛋白質變性。于4℃條件下靜置過夜,至結晶析出。為加速其結晶 過程,可加入適量溶菌酶晶種(晶種制備:將市售溶菌酶粉劑配制成5%水溶液,每10mL加入Nacl 0.5g,滴加1M NaOH溶液調pH值至9.5—10.0,置4℃冰箱中,結晶析出即成)。不加晶種兩周左右結晶率最高,反之72—96h最高。8結晶過濾或分離:用濾紙或尼龍布過濾,或用離心機離心10min,得到溶菌酶結晶。 9結晶洗滌:用丙酮將溶菌酶結晶洗滌數次(一般3次即可)。10干燥:將溶菌酶結晶在常溫或(50-60) ℃條件下干燥制成成品,水分含量質量分數約為(2-3)%。方法二——離子交換法一.材料原料與試劑:鮮雞蛋(市售)、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銨、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、丙酮、724型陽離子交換樹脂等,以上藥品均為分析純。主要儀器:分光光度計(7230G型)、攪拌器(200~300rpm)、離心機(4000rpm)。二.工藝流程三.實驗步驟1蛋黃與蛋清的分離。取新鮮的雞蛋,去殼,經分離器后,使蛋清與蛋黃分離。打破蛋殼時應避免蛋黃破散,使兩者完全分離。2蛋清的預處理。將分離后的蛋清加入到攪拌器中,200-300 rpm下攪拌10min,再將蛋清攪拌稠度均勻即可,以不引起發泡為宜。最后用2-3層紗布過濾,以除去殘余蛋殼和少量蛋黃。3 吸附。將過濾后的蛋清冷至5℃后移入搪瓷捅中,然后在攪拌下加入已處理好的樹脂(14%加入),使其懸浮在蛋清中,在0~5℃下,攪拌吸附5h,然后在 0-6℃靜置20h以上,等分層后,棄去上清液后的樹脂用清水反復沖洗2-3次。以除去雜蛋白,最后晾干樹脂,移入一個搪瓷缸中。4酶的洗 脫。在上述樹脂中加入同體積的0.15 mol/L的pH 6.5磷酸鹽緩沖液,攪拌洗脫20min,過濾洗脫液,除去一部分雜質。再重復洗脫2次。將除去雜質的樹脂加入等量濃度為10%的硫酸銨溶液,攪拌洗脫 30min,濾出洗脫液,重復洗脫3次,濾出的洗脫液一起倒入沉淀缸中沉淀。5沉淀。在沉淀缸中按洗脫液的體積加入32%固體硫酸銨,攪拌使其溶解,在4℃放置過夜。第2天,用虹吸法取出上清,4000rpm離心10min分離沉淀物。6透析。將沉淀物用蒸餾水全部溶解,然后放入透析袋中,在10℃水中透析過夜,以除去沉淀中的硫酸銨。收集透析液。7鹽析。將透析液移入一容器內,用0.1mol/L的NaOH調溶液pH至8.5~9.0,有白色沉淀時,應立即離心除去沉淀。用2mol/L HCl調pH至3.5,攪拌,并在0℃放置48h,同上離心收集沉淀物。8成品的干燥。將上述沉淀物加入到丙酮,攪拌。放置2h,收集沉淀,用冷凍干燥法干燥沉淀即得產品。干燥的溶菌酶可在室溫下長期保存。其純品為白色或微黃色的結晶體或粉末,無臭,味甜,易溶于水,不溶于丙酮、乙醚等有機溶劑。方法三——離子交換法一.實驗材料雞蛋(新鮮) 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、 丙酮、 硫酸銨、724 型陽 離子交換樹脂等。二.工藝流程硫酸 洗脫蒸餾水,溶解pH=3.5,固體NaCl鹽析三.實驗步驟(1)樹脂處理:將724 樹脂先用 w( NaOH)= 7%的溶液浸泡 2h,濾出樹脂涼干, 再用 c(HCI)= 0.1moI / L的溶液浸泡 8 h,濾出樹脂涼干后,用w(NaCI)= 10% 的溶液浸泡 8 h,濾出樹脂涼干備用。(2)緩沖液配制: 取30 . 0 g NaH2 PO4 及 35.8 g Na2 HPO4 溶于 1 L 水中即得 pH = 6.5 的磷酸鹽緩沖液。(3)原料處理:新鮮的蛋清用 pH 試紙測其 pH值應為 8 . 0 左右。(4)吸附:用冰水冷卻并攪拌蛋清,使溫度降到5 ℃,緩緩加入 724 型樹脂,在不斷攪拌下使樹脂完全懸浮于蛋清中,保持溫度 0 ~ 10 ℃ ,繼續攪拌 5 h,然后將蛋清在 0 ~ 10 ℃靜置 12h以上。(5)洗滌、 洗脫:把上層蛋清傾出,下層樹脂用清水洗去附著的蛋白質,先后共洗滌四次,最后將樹脂濾去水分,用磷酸鹽緩沖液分三次加入攪拌,每次攪拌 15 min 后抽濾去水分, 然后用ψ(H2 SO4)=1% 的稀硫酸分四次洗脫溶菌酶,合并洗脫液,在洗脫液中加入 w〔(NH4)2 SO4〕=40% 的溶液,析出白色沉淀。在 0 ~ 10 ℃靜置 12 h 以上,過濾出沉淀。(6)透析:將沉淀溶于蒸餾水中,在 0 ~ 10 C℃透析 24 h, 除去大部分硫酸銨。(7) 鹽析: 用滴管慢慢加入氫氧化鈉溶液, pH 使= 8 . 5 ~ 9 . 0,如有白色沉淀,應即離心除去, 然后在攪拌下加入 c(HCI)= 3.0 mOI / L 的鹽酸,使溶液 pH= 3.5。按鹽析液的體積緩緩加入 w(NaCI)=5% 的固體氯化鈉,則有白色沉淀生成, 0 ~ 10 ℃靜置 48h,抽濾得到溶菌酶粗品。(8)精制:將粗品溶菌酶溶入 0 ℃無水丙酮中,控制溶液的ρ(粗溶菌酶)= 100 g / L,緩慢攪拌使顆粒松細,在 0 ~ 10 C℃靜置數小時,濾去丙酮, 沉淀真空干燥,即得溶菌酶精品。如果不用丙酮脫水,將透析液冷凍干燥可得不含氯化鈉的溶菌酶。按蛋清質量計收率為 0.14% 。方法四——離子交換法(改進工藝)1.將新鮮雞蛋洗凈、控干水、敲破小頭、收集蛋清,4℃放置1h以上。2.724樹脂的處理:用1mol/L HCl浸泡樹脂2h,用去離子水洗至近中性,再用1mol/L NaOH 浸泡2h ,用去離子水洗至近中性 (用過的樹脂直接用1mol/L NaOH浸泡,用去離子水洗至近中性) 再用0.15mol/L pH6.5的磷酸鹽緩沖液浸泡過夜,濾后備用。3.吸附。將冷蛋清加入處理好的 724樹脂 (每千克蛋清需要未處理樹脂160g) 大力攪(冰浴中)吸附6h,4℃靜置, 次日離心(3000r/min,15min),收集樹脂,回收蛋清。4.洗去雜蛋白。樹脂先用去離子水洗至洗液無渾濁, 再用等體積的0.15mol/L pH6.5的磷酸鹽緩沖液攪拌洗滌20min(冰浴下) 攪拌洗滌應重復 2次,最后1次濾除樹脂水分。5. 洗脫溶菌酶。樹脂用等體積的10%的(NH4)2SO4浸泡,4℃下過夜,次日攪拌30min,洗脫液經尼龍布過濾,準確量取體積。 再加入體積10%的(NH4)2SO4重復洗脫2次,合并洗脫液。6.鹽析溶菌酶。每83ml洗脫液加32g磨細的固體(NH4)2SO4,在攪拌下緩慢加入, 待(NH4)2SO4完全溶解后,4℃放置過夜。次日,離心(3000r/min,15min), 收集沉淀。7.透析除鹽。將鹽析沉淀裝入透析袋, 用蒸餾水透析24h以上,其間換2次蒸餾水。8. 去雜質。取出透析袋中的透析液,用 2mol/L HCl調整pH4.6,離心,收集上清液。其沉淀加少量蒸餾水(約為沉淀的5倍)攪勻,再重復處理 2次。合并上清液、調整pH5.5,再加,1mol/L NaHPO4—KH2PO4 緩沖液(pH5.5),達終濃度為10mmol/L,靜置10min、離心、棄沉淀,收集純化液。9.濃縮與干燥。純化液在(40±2)℃真空旋轉蒸發,變濁時倒出、 冷凍,室溫真空干燥。方法五——陽離子交換法一.實驗材料1.陽離子交換樹脂(732)樹脂,聚丙烯酰胺凝膠(sDs—PAGE)2.乙酸和配緩沖液用的磷酸鈉與氫氧化鈉等試劑均為分析純(AR級)。3.雞蛋從自由市場上隨機購買,新鮮無異常。二.實驗步驟1按照國家有關標準方法配置pH6、pH7、pH8、pH9的四種磷酸緩沖液。2雞蛋清樣品處理方法去蛋殼,手工分離得雞蛋白,分別加pH6到pH9的緩沖液充分浸泡蛋白,均質處理上述緩沖液處理過的蛋白液(四種磷酸緩沖蛋白液)。3 分離層析柱制備及溶菌酶分離方法732樹脂經多重蒸餾水處理后,小心灌人1X30 cm的柱中,再以PH6到9的緩沖液分別洗滌,制得四種緩沖能力的732樹脂分離柱。將上述四種磷酸緩沖蛋白液分別移入相應pH值緩沖液處理過的分離柱, 以相應緩沖液洗脫一定時間后,再以0.1 mol/L的乙酸洗脫,在整個洗脫過程中,洗脫液每10 ml收集一管,收集到的洗脫液立即經280nm檢驗溶菌酶和其它雜蛋白的洗脫順序。洗脫下來的溶菌酶經冷凍于燥計算其得率,得率的計算方法是每百克鮮雞蛋 清蛋白中含凍干溶菌酶粗制品的克數。方法六——陽離子交換法1.試驗材料預處理。雞蛋清樣品預處理:取新鮮蛋清,用4層紗布過濾,除去雜物。用磁力攪拌器攪拌10min,均質,速度以不引起蛋清起泡為宜。離 子交換樹脂的預處理:稱?。保埃?g離子交換樹脂,用1 mol/L鹽酸1000mL浸泡12 h,傾出上清液,用清水沖洗至pH值為6.0左右,再用80℃熱水800 mL浸泡4 h,過濾,用1 mol/L氫氧化鈉溶液浸泡12 h,傾出上清液,用清水沖洗至pH值為9.0左右。用水浸泡備用。2.離子交換法提取溶菌酶吸附:將蛋清冰浴冷卻至5℃左右,攪拌下加入30%已處理好的D152離子交換樹脂,使樹脂全部懸浮在蛋清中。保溫攪拌吸附8 h。然后靜置分層,棄去上層清液(可回收制備蛋粉),下層樹脂用清水反復洗3次,以除去雜蛋白,最后濾干樹脂。洗脫:在上述樹脂中加入等體積濃度為10%的硫酸銨溶液,攪拌洗脫60min,濾出洗脫液,重復洗脫樹脂3次,合并濾出的洗脫液。丙酮沉淀法:將上述所得洗脫液,用冰浴降溫到4℃,攪拌下將預冷到-10℃的2倍體積的丙酮逐滴加入,放置10min,然后離心,收獲沉淀。干燥:將沉淀的鹽析物倒入丙酮中,不斷攪拌,放置2h左右,濾除丙酮,放人真空干燥箱40℃下干燥4h,得成品,稱重,測酶活。
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